Иммуноферментный анализ и его модификации¶

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. enzyme immunoassay, EIA) — лабораторный метод количественного и качественного определения биологически активных веществ (антигенов, антител, гормонов, белков) в биологических жидкостях, основанный на специфическом связывании антигена с антителом и последующей регистрации этого связывания с помощью ферментной метки. Термин «имунофераза» (от лат. immunis — «свободный от податей, защитный» и греч. φέρω — «несу») в русскоязычной литературе иногда используется как неточный синоним, обозначающий фермент, конъюгированный с иммуноглобулином, то есть иммуноферментный конъюгат. Корректное название метода — иммуноферментный анализ.

¶История

Метод возник на стыке иммунологии и энзимологии во второй половине XX века. В 1960-х годах исследователи Розалин Ялоу и Сол Берсон разработали радиоиммунный анализ (РИА), где меткой служил радиоактивный изотоп. Метод был высокочувствительным, но требовал дорогого оборудования, специальных условий хранения реагентов и мер радиационной защиты.

В 1971 году независимо друг от друга голландские исследователи Эва Энгвалл и Петер Перлманн, а также шведские учёные Антон Шуурс и Бауке ван Вемен предложили заменить радиоактивную метку на фермент. Это положило начало иммуноферментному анализу. В качестве метки использовали пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и β-галактозидазу. Метод быстро распространился благодаря стабильности реагентов, безопасности и возможности автоматизации.

В 1980-х годах ИФА стал рутинным инструментом клинической диагностики. Появление планшетных фотометров и автоматических анализаторов сделало его массовым. Дальнейшее развитие привело к созданию хемилюминесцентных, электрохемилюминесцентных и флуоресцентных вариантов, сохранивших иммуноферментный принцип.

¶Принцип метода

Основу составляет реакция «антиген — антитело». Один из компонентов (антиген или антитело) иммобилизуют на твёрдой фазе — поверхности лунок планшета, магнитных частиц или мембраны. Второй компонент, меченный ферментом, образует с ним комплекс. После отмывки несвязавшихся реагентов вносят субстрат, который под действием фермента превращается в окрашенный, флуоресцирующий или люминесцирующий продукт. Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации искомого вещества.

Ключевые этапы:

1. Сорбция антигена или антитела на твёрдой фазе.
2. Внесение исследуемого образца и связывание с иммобилизованным компонентом.
3. Добавление ферментного конъюгата.
4. Отмывка для удаления несвязавшихся молекул.
5. Внесение субстрата и остановка реакции.
6. Регистрация оптической плотности на фотометре.

¶Основные варианты

¶Ферменты-метки

К ферменту-метке предъявляют требования: высокая каталитическая активность, стабильность, доступность субстрата, отсутствие эндогенных аналогов в образце. Наиболее распространены:

• Пероксидаза хрена — субстрат тетраметилбензидин (ТМБ), даёт синее окрашивание, переходящее в жёлтое после остановки кислотой.
• Щелочная фосфатаза — субстрат пара-нитрофенилфосфат, продукт жёлтого цвета.
• β-галактозидаза — используется реже, преимущественно в исследовательских целях.

¶Применение

ИФА применяется в клинической лабораторной диагностике, научных исследованиях, ветеринарии, контроле пищевой продукции и экологическом мониторинге.

Основные направления:

• Инфекционная серология: выявление антител к ВИЧ, вирусам гепатитов B и C, возбудителям сифилиса, кори, краснухи, а также антигенов SARS-CoV-2.
• Эндокринология: определение гормонов щитовидной железы, инсулина, кортизола, половых гормонов.
• Онкомаркеры: ПСА, АФП, РЭА, CA-125.
• Аллергология: определение специфических IgE.
• Пищевая промышленность: выявление остатков антибиотиков, микотоксинов, аллергенов.

¶Достоинства и ограничения

К преимуществам относят высокую чувствительность (до пикограммов на миллилитр), специфичность, безопасность (отсутствие радиоактивных изотопов), возможность автоматизации и стандартизации, относительно низкую стоимость по сравнению с молекулярными методами.

Ограничения: возможность ложноположительных и ложноотрицательных результатов при перекрёстных реакциях, влияние ревматоидного фактора и гетерофильных антител, «эффект хука» при очень высокой концентрации антигена, необходимость строгого соблюдения условий инкубации и отмывки. Результаты ИФА обычно подтверждают дополнительными методами — иммуноблоттингом или полимеразной цепной реакцией.

¶Значение

ИФА остаётся одним из наиболее распространённых иммунохимических методов в мире. На его основе построены массовые скрининговые программы, диагностика инфекционных и эндокринных заболеваний, контроль качества лекарств и продуктов питания. Дальнейшее развитие связано с цифровыми и мультиплексными платформами, позволяющими определять десятки аналитов одновременно.