Иммуноферментный анализ в диагностике¶

Иммуноферментный анализ в диагностике — метод лабораторного исследования, основанный на специфическом связывании антигена с антителом, при котором образование иммунного комплекса выявляется с помощью ферментной метки, катализирующей цветную или люминесцентную реакцию. Метод относится к иммуноаналитическим (иммунохимическим) способам детекции и широко применяется для количественного и качественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях.

¶Принцип метода

Основу составляет реакция «антиген — антитело». Один из компонентов (антиген или антитело) иммобилизован на твёрдой фазе — обычно на лунках планшета из полистирола. Второй компонент конъюгирован с ферментом-маркером, чаще всего пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. После образования комплекса вносят субстрат, который под действием фермента превращается в окрашенный продукт. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации определяемого вещества и регистрируется спектрофотометром (ридером).

¶Основные варианты

• Прямой ИФА — антиген связывается с меченым специфическим антителом; применяется редко, преимущественно в научных целях.
• Непрямой ИФА — антиген выявляют немеченым первичным антителом, а затем меченым вторичным; используется для определения антител в сыворотке.
• Сэндвич-ИФА (двухсайтовый) — антиген «зажат» между иммобилизованным и меченым антителами; наиболее чувствительный вариант для определения антигенов.
• Конкурентный ИФА — меченый и немеченый аналиты конкурируют за ограниченное число центров связывания; применяется для низкомолекулярных соединений.

¶Применение в диагностике

ИФА служит рутинным инструментом клинической лабораторной диагностики:

Метод применяется также в ветеринарии, контроле качества пищевых продуктов, обнаружении остатков антибиотиков и пестицидов, допинг-контроле.

¶Преимущества и ограничения

К достоинствам относят высокую чувствительность (обнаружение нанограммовых количеств вещества), специфичность, возможность автоматизации и стандартизации, относительно невысокую стоимость и безопасность (отсутствие радиоактивных изотопов в отличие от радиоиммунного анализа). Существенным является и возможность одновременного исследования множества проб в одном планшете.

Ограничения связаны с возможностью ложноположительных и ложноотрицательных результатов: перекрёстные реакции, эффект «хук» при очень высокой концентрации антигена, интерференция ревматоидного фактора и гетерофильных антител. Поэтому положительные результаты ИФА, особенно при инфекционной диагностике, как правило, подтверждают другими методами — иммуноблоттингом, ПЦР, культуральным исследованием.

¶История и развитие

Метод разработан в 1971 году независимо двумя группами исследователей — П. Перлманом и Е. Энгваллем в Швеции и Р. Ялоу и С. Берсоном в США (последние ранее предложили радиоиммунный анализ). Замена радиоактивной метки на ферментную сделала анализ безопасным и доступным для массовых лабораторий. В дальнейшем появились варианты с хемилюминесцентной и флуоресцентной детекцией, повысившие чувствительность, а также автоматические анализаторы, обеспечивающие высокую пропускную способность. Современные платформы позволяют проводить количественный анализ с коэффициентом вариации в пределах нескольких процентов.