Сурбуфер — буферный раствор в биохимии¶

Сурбуфер — общее название группы буферных растворов, применяемых в молекулярной биологии, биохимии и клинической лабораторной диагностике для поддержания стабильного значения pH в реакционных смесях. Название происходит от англ. SureBuffer — торгового наименования одного из первых коммерческих препаратов этого класса, выпущенного компанией Sigma-Aldrich; впоследствии термин закрепился как нарицательное обозначение буферных систем на основе трис(гидроксиметил)аминометана (Трис) и ряда других органических оснований, используемых в протоколах выделения нуклеиновых кислот, электрофореза и иммуноферментного анализа.

¶Общие сведения

Буферным называют раствор, способный сохранять практически постоянное значение pH при добавлении небольших количеств кислоты или щёлка, а также при разбавлении. Действие основано на равновесии слабой кислоты и её сопряжённого основания (или слабого основания и сопряжённой кислоты). В биологических экспериментах буферы необходимы, поскольку большинство ферментов, нуклеиновых кислот и белков работоспособны лишь в узком диапазоне pH, обычно близком к физиологическому (7,2–7,4).

Сурбуферы отличаются от классических буферов (ацетатного, фосфатного, боратного) тем, что оптимизированы специально для работы с биологическими макромолекулами: они обладают низкой ионной силой, слабо связывают ионы металлов, не ингибируют ферменты и не поглощают свет в ультрафиолетовой области спектра, где обычно ведётся детекция нуклеиновых кислот.

¶Состав и разновидности

Типичный сурбуфер представляет собой водный раствор Трис-основания, доведённый до нужного pH соляной кислотой или уксусной кислотой. В зависимости от задачи в него добавляют:

• ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту) — хелатирующий агент, связывающий ионы магния и кальция и инактивирующий нуклеазы;
• NaCl или KCl — для создания определённой ионной силы;
• детергенты (Tween 20, Triton X-100) — для солюбилизации мембранных белков;
• восстанавливающие агенты (дитиотреитол, 2-меркаптоэтанол) — для защиты сульфгидрильных групп;
• глицерин — для повышения плотности раствора и стабилизации ферментов при хранении.

Наиболее распространённые варианты:

Строго говоря, PBS и TBS — не Трис-буферы, однако в лабораторной практике их часто относят к тому же классу «сурбуферов» из-за сходного назначения.

¶Применение

Сурбуферы используются практически на всех этапах работы с биологическим материалом.

Выделение нуклеиновых кислот. При лизисе клеток и последующей очистке ДНК или РНК буфер обеспечивает нужный pH для работы протеиназы К и стабилизирует молекулы, предотвращая их кислотный гидролиз. ЭДТА в составе связывает ионы Mg²⁺, необходимые для активности ДНКаз.

Электрофорез. В TAE- и TBE-буферах проводят разделение фрагментов ДНК в агарозном или полиакриламидном геле. Буфер выполняет двойную функцию: поддерживает pH и обеспечивает электропроводность среды, по которой течёт ток.

Хроматография и очистка белков. Трис-буферы применяют в ионообменной и аффинной хроматографии, при этом важно, чтобы pH буфера отличался от изоэлектрической точки целевого белка.

Иммуноферментный анализ и иммуноблоттинг. Буферы применяются для разведения антител, блокировки неспецифического связывания и отмывки мембран.

Клиническая диагностика. Сурбуферы входят в состав реагентов для ПЦР-тестирования, определения глюкозы, ферментов крови и других анализов.

¶Свойства и ограничения

Ключевые характеристики, которыми должен обладать хороший сурбуфер:

• буферная ёмкость — способность нейтрализовать определённое количество кислоты или щёлочи без заметного сдвига pH; максимальна при pH, равном pKa буферной системы (для Триса pKa ≈ 8,1 при 25 °C);
• температурная зависимость — pKa Триса существенно падает при нагревании (примерно на 0,03 единицы на градус), что важно учитывать при постановке ПЦР;
• инертность — отсутствие взаимодействия с ферментами, мембранами и анализируемыми веществами;
• отсутствие УФ-поглощения в диапазоне 260–280 нм.

Ограничения связаны с тем, что Трис способен реагировать с альдегидами и некоторыми сшивающими реагентами, а также плохо совместим с реакциями, требующими свободных ионов металлов. В таких случаях применяют альтернативные буферы — HEPES, MOPS, PIPES.

¶Хранение и приготовление

Концентрированные маточные растворы сурбуферов (обычно 10× или 20×) готовят заранее и хранят при комнатной температуре или в холодильнике. Перед использованием их разводят деионизированной водой до рабочей концентрации. Стерилизацию проводят автоклавированием, если компоненты термостойки; растворы с ЭДТА и детергентами часто фильтруют через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм. Готовые рабочие растворы рекомендуется хранить не более нескольких недель, поскольку возможно микробное загрязнение и постепенное смещение pH.