ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний¶

ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний — метод лабораторной диагностики, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и направленный на обнаружение в биологическом материале нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) возбудителей инфекций. Метод позволяет выявлять генетический материал бактерий, вирусов, грибов и простейших даже при их крайне низкой концентрации в пробе, что делает его одним из наиболее чувствительных и специфичных способов этиологической диагностики.

¶Принцип метода

Полимеразная цепная реакция представляет собой многократное избирательное копирование (амплификацию) определённого участка нуклеиновой кислоты. Реакция идёт в термоциклере, который циклически меняет температуру, обеспечивая денатурацию цепей ДНК, присоединение праймеров и синтез новых цепей ферментом ДНК-полимеразой. Каждый цикл удваивает число копий целевого фрагмента, поэтому за 30–40 циклов количество продукта возрастает в миллиарды раз.

Ключевые компоненты реакции:

• матрица — исследуемая нуклеиновая кислота возбудителя;
• праймеры — короткие синтетические олигонуклеотиды, комплементарные участку-мишени;
• ДНК-полимераза (термостабильный фермент);
• нуклеотиды и буферная среда с ионами магния.

Для выявления РНК-содержащих вирусов предварительно проводят обратную транскрипцию — синтез комплементарной ДНК (метод ОТ-ПЦР).

¶Этапы исследования

1. Забор материала — мазки со слизистых, кровь, плазма, мокрота, моча, ликвор, биоптаты.
2. Пробоподготовка — выделение нуклеиновых кислот, очистка от ингибиторов.
3. Амплификация — собственно ПЦР в термоциклере.
4. Детекция продукта — электрофорез, флуоресцентная регистрация в реальном времени или гибридизационные методы.

¶Разновидности

¶Применение

Метод используется для диагностики широкого круга инфекций: вирусных гепатитов, ВИЧ, туберкулёза, герпесвирусных инфекций, респираторных вирусных заболеваний, хламидиоза, микоплазмоза, а также для контроля эффективности терапии и определения вирусной нагрузки. Во время пандемии COVID-19 ПЦР-тестирование стало основным способом подтверждения инфекции.

¶Преимущества и ограничения

К достоинствам относят высокую чувствительность (обнаружение единичных копий генома), специфичность, скорость получения результата (несколько часов) и возможность выявления возбудителей, плохо растущих на питательных средах.

Ограничения связаны с риском контаминации пробы, необходимостью строгого контроля качества, дорогостоящим оборудованием и тем, что метод обнаруживает нуклеиновые кислоты, но не всегда различает жизнеспособный возбудитель и его остатки. Ложноотрицательные результаты возможны при неправильном заборе материала или низкой концентрации возбудителя в пробе.