Иммуноферментный анализ: метод и применение¶

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный метод количественного и качественного определения биологически активных веществ (антигенов, антител, гормонов, белков) в биологических жидкостях, основанный на специфическом связывании «антиген — антитело» и последующей ферментативной детекции образовавшегося комплекса. Метод сочетает высокую чувствительность ферментных реакций с избирательностью иммунологического узнавания и широко применяется в клинической диагностике, научных исследованиях, ветеринарии и контроле качества пищевой продукции.

¶История

Основы иммунохимического анализа заложены в 1950–1960-х годах, когда Розалин Ялоу и Соломон Берсон разработали радиоиммунологический метод (РИА), за который Ялоу получила Нобелевскую премию по физиологии и медицине (1977). Радиоизотопные метки обеспечивали высокую чувствительность, но требовали специального оборудования и создавали радиационную опасность.

В 1971 году независимо друг от друга группы под руководством Эвы Энгвалль (Швеция) и Питера Перлманна и Антона Шуурса (Нидерланды) предложили заменить радиоактивную метку на ферментную. В качестве метки использовали щелочную фосфатазу и пероксидазу хрена. Так возник иммуноферментный анализ, лишённый недостатков РИА и быстро вытеснивший его из рутинной практики. К 1980-м годам метод стал стандартом клинической лабораторной диагностики.

¶Принцип метода

В основе ИФА лежат два ключевых принципа:

• Иммунологическая специфичность — антитело связывается только с соответствующим антигеном, образуя комплекс «антиген — антитело».
• Ферментативное усиление сигнала — к антителу или антигену присоединён фермент, который при добавлении субстрата катализирует цветную, флуоресцентную или люминесцентную реакцию. Одна молекула фермента превращает множество молекул субстрата, что многократно усиливает регистрируемый сигнал.

Интенсивность окраски или свечения пропорциональна количеству искомого вещества, что позволяет проводить количественное определение по калибровочной кривой.

¶Основные варианты

Наибольшее распространение получил «сэндвич»-вариант благодаря высокой чувствительности и специфичности.

¶Этапы проведения

1. Сорбция антигена или антител на поверхности лунок планшета (обычно полистирольного).
2. Блокирование свободных участков инертным белком для снижения неспецифического связывания.
3. Внесение образца и инкубация; при наличии искомого вещества образуется комплекс.
4. Отмывка для удаления несвязавшихся компонентов.
5. Добавление конъюгата — антитела, связанного с ферментом.
6. Внесение субстрата; фермент катализирует цветную реакцию.
7. Стоп-реагент и регистрация оптической плотности на спектрофотометре (ридере).

¶Применение

• Инфекционная диагностика — выявление антител и антигенов возбудителей ВИЧ, гепатитов B и C, сифилиса, туберкулёза, коронавирусных инфекций.
• Эндокринология — определение гормонов щитовидной железы, инсулина, кортизола.
• Онкология — опухолевые маркеры (ПСА, АФП, РЭА).
• Аллергология — определение специфических IgE.
• Пищевая промышленность — обнаружение аллергенов, остатков антибиотиков, микотоксинов.
• Ветеринария и экология — мониторинг загрязнений и заболеваний животных.

¶Преимущества и ограничения

К достоинствам относят высокую чувствительность (обнаружение нанограммовых и пикограммовых количеств), специфичность, воспроизводимость, возможность автоматизации и относительно невысокую стоимость по сравнению с радиоиммунным анализом. Метод безопасен, так как не использует радиоактивные изотопы.

Ограничения связаны с возможностью ложноположительных и ложноотрицательных результатов из-за перекрёстных реакций, эффекта «хука» при очень высоких концентрациях, а также с влиянием качества реагентов и условий хранения. Поэтому результаты ИФА обычно подтверждают другими методами (ПЦР, иммуноблот, культуральные исследования).

¶Значение

Иммуноферментный анализ остаётся одним из наиболее востребованных методов лабораторной диагностики. Он обеспечил массовый скрининг инфекций, контроль гормонального статуса и онкомаркеров, а также стал основой для создания экспресс-тестов и автоматизированных диагностических платформ. Развитие технологии связано с появлением хемилюминесцентных и электрохемилюминесцентных вариантов, повышающих чувствительность и расширяющих диапазон измеряемых концентраций.