Иммуноферментный анализ и его модификации¶

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. enzyme immunoassay, EIA) — лабораторный метод количественного и качественного определения биологически активных веществ (антигенов, антител, гормонов, белков, низкомолекулярных соединений) в биологических жидкостях, основанный на специфическом связывании антигена с антителом и последующей регистрации образовавшегося комплекса с помощью ферментной метки. Термин «иммунофераза» нередко встречается в русскоязычной литературе и патентных документах как синоним или близкое обозначение иммуноферментных систем, в которых фермент (пероксидаза, щелочная фосфатаза) выступает в роли маркера. Метод сочетает высокую специфичность иммунологической реакции с чувствительностью ферментативного катализа и широко применяется в клинической диагностике, биотехнологии, ветеринарии и экологическом мониторинге.

¶История

Принцип меченых антител был предложен в 1941 году американскими учёными Альбертом Кунсом и Розалин Каплан, применившими флуоресцентные метки для визуализации антигенов в тканях. В 1960-х годах С. Аврамеас и Ж. Уриель во Франции, а также П. Накане и А. Пирс в Великобритании независимо разработали методы конъюгации антител с ферментами. Ключевой вклад внёс Эва Энгвалл (Швеция), который в 1971 году совместно с Перлманном опубликовал работу по «enzyme-linked immunosorbent assay» (ELISA) — варианту гетерогенного ИФА с сорбцией реагентов на твёрдой фазе. За эту разработку метод получил широкое признание, а аббревиатура ELISA стала общепринятой в международной практике. В СССР и России метод внедрялся с 1970–1980-х годов, в том числе в институте им. Н. Ф. Гамалеи и Институте биоорганической химии.

¶Принцип метода

Основу ИФА составляет иммунологическая реакция «антиген — антитело». Один из компонентов (антиген или антитело) иммобилизуют на твёрдой фазе — чаще всего на поверхности лунок полистиролового планшета. После внесения исследуемого образца происходит связывание целевого вещества. Затем добавляют конъюгат — антитело или антиген, соединённый с ферментом. Нерасвязавшиеся компоненты удаляют отмывкой, после чего вносят субстрат. Фермент катализирует превращение субстрата в окрашенный продукт, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству искомого вещества. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре (ридере) при определённой длине волны.

В качестве ферментов-меток обычно используют:

• пероксидазу хрена (HRP) — субстрат тетраметилбензидин (ТМБ);
• щелочную фосфатазу (AP) — субстрат пара-нитрофенилфосфат (pNPP);
• β-галактозидазу;
• глюкозооксидазу.

¶Классификация вариантов

По способу разделения связавшихся и несвязавшихся компонентов выделяют гетерогенный (с отмывкой, классический ELISA) и гомогенный (без отмывки) анализ. По типу детекции различают конкурентный и неконкурентный («сэндвич») варианты.

¶Применение

ИФА занимает одно из центральных мест в клинической лабораторной диагностике. Метод используется для выявления инфекционных агентов (вирусы гепатитов B и C, ВИЧ, SARS-CoV-2), определения гормонов (тиреотропный гормон, тироксин, кортизол, инсулин), онкомаркёров (ПСА, АФП, РЭА), аутоантител, аллергенспецифических IgE. В ветеринарии ИФА применяют для диагностики инфекций животных, в пищевой промышленности — для обнаружения аллергенов, антибиотиков и микотоксинов, в экологии — для мониторинга загрязнителей. Метод лежит в основе многих тест-систем для домашнего использования, включая экспресс-тесты на беременность (иммунохроматография — родственная технология).

¶Преимущества и ограничения

К достоинствам ИФА относят высокую чувствительность (обнаружение вещества в концентрациях до 10⁻¹² г/мл), специфичность, возможность автоматизации и стандартизации, относительно невысокую стоимость и безопасность (в отличие от радиоиммунного анализа не требует радиоактивных изотопов). Ограничения связаны с возможностью ложноположительных и ложноотрицательных результатов при перекрёстных реакциях, влиянием «эффекта зоны» (избытка антигена), необходимостью тщательной отмывки и контроля качества реагентов. Результаты ИФА, как правило, требуют подтверждения другими методами (иммуноблот, ПЦР) при постановке окончательного диагноза.

¶Развитие технологии

Современные модификации включают хемилюминесцентный иммуноанализ (ХЛИА), электрохемилюминесцентный анализ (ECLIA), флуоресцентный и мультиплексный варианты, позволяющие определять десятки аналитов одновременно (технология Luminex). Развиваются цифровые и микрофлюидные платформы, а также полностью автоматизированные анализаторы, применяемые в крупных лабораториях.