РНКаза A: панкреатическая рибонуклеаза¶

РНКаза A — фермент класса гидролаз, относящийся к группе рибонуклеаз; панкреатическая рибонуклеаза, секретируемая поджелудочной железой и катализирующая расщепление молекул РНК. Это один из наиболее изученных ферментов в истории биохимии: на его примере впервые были установлены принципы работы ферментов, механизмы сворачивания белков и заложены основы экспериментов по определению первичной структуры белковых молекул. Молекулярная масса фермента составляет около 13,7 кДа, он состоит из одной полипептидной цепи длиной 124 аминокислотных остатка.

¶История изучения

Панкреатическая рибонуклеаза была выделена в 1920-х годах американским биохимиком Мозесом Кунитцем, который установил её белковую природу и показал, что она гидролизует РНК, но не ДНК. В 1960-х годах Кристиан Анфинсен использовал этот фермент в классических опытах по денатурации и ренатурации: он показал, что после разрушения нативной структуры (обработкой мочевиной и восстановителями) белок самопроизвольно восстанавливает свою конформацию и ферментативную активность. За эти работы Анфинсен был удостоен Нобелевской премии по химии в 1972 году (совместно со Стэнфордом Муром и Уильямом Стайном).

В 1967 году Уильям Стайн и Стэнфорд Мур определили полную аминокислотную последовательность РНКазы A, а в 1969 году Ричард Дикерсон установил её трёхмерную структуру методом рентгеноструктурного анализа. В 1972 году Роберт Меррифилд, разработавший метод твердофазного синтеза пептидов, осуществил полный химический синтез фермента, подтвердив корректность установленной структуры.

¶Структура и механизм действия

Молекула РНКазы A имеет глобулярную форму, стабилизированную четырьмя дисульфидными связями между остатками цистеина. Вторичная структура включает три α-спирали и несколько β-слоёв. Активный центр образуют остатки гистидина (His12 и His119), лизина (Lys41) и аспарагиновой кислоты (Asp121).

Фермент расщепляет фосфодиэфирные связи в одноцепочечных РНК по механизму трансэстерификации: сначала образуется циклический 2',3'-фосфат, который затем гидролизуется до 3'-фосфомоноэфира. РНКаза A действует преимущественно на пиримидиновые нуклеотиды — цитидин и уридин, — проявляя высокую специфичность. Оптимум активности приходится на слабощелочную среду (pH около 7,7).

¶Биологическая роль

Основная функция фермента — внеклеточное расщепление РНК, поступающей в пищеварительный тракт. РНКаза A синтезируется в ацинарных клетках поджелудочной железы в виде неактивного предшественника и секретируется в составе панкреатического сока в двенадцатиперстную кишку. Помимо пищеварительной функции, ферменты этого семейства участвуют в защите организма от чужеродных нуклеиновых кислот и в регуляции обмена РНК.

¶Применение

Благодаря стабильности и высокой специфичности РНКаза A широко используется в лабораторной практике:

• удаление РНК из препаратов ДНК при молекулярно-биологических исследованиях;
• картирование РНК и определение нуклеотидных последовательностей;
• изучение механизмов сворачивания белков и ферментативного катализа;
• тестирование ингибиторов ферментов в фармакологических исследованиях.

Фермент остаётся модельным объектом в биохимии, молекулярной биологии и структурной биологии, а его ингибитор — цитоплазматический белок RNasin — применяется для защиты РНК при работе с ней.