Химотрипсин как пищеварительный фермент¶

Химотрипсин — сериновая протеаза (фермент класса гидролаз), входящая в состав пищеварительных соков позвоночных животных и человека. Расщепляет белки и пептиды по связям, образованным ароматическими и некоторыми другими гидрофобными аминокислотами. Синтезируется в поджелудочной железе в виде неактивного предшественника — химотрипсиногена, который активируется в двенадцатиперстной кишке. Химотрипсин относится к семейству химотрипсинподобных сериновых протеаз (клану PA, семейство S1), в которое входят также трипсин, эластаза и ряд других ферментов.

¶История изучения

Белковую природу пищеварительных ферментов поджелудочной железы в конце XIX века показали работы немецких физиологов Вильгельма Кюне и Рудольфа Гейденгайна. Кюне в 1876 году выделил из сока поджелудочной железы вещество, расщепляющее белки, и предложил для него термин «трипсин». Позднее было установлено, что панкреатический сок содержит не один, а несколько протеолитических ферментов.

В 1930-х годах американские биохимики Джон Нортроп и Мозес Кунитц получили химотрипсин в кристаллическом виде и показали, что он образуется из неактивного предшественника под действием трипсина. За работы по кристаллизации ферментов Нортроп был удостоен Нобелевской премии по химии (1946). В 1967 году Дэвид Бланделл и его коллеги методами рентгеноструктурного анализа установили трёхмерную структуру химотрипсина — одну из первых расшифрованных структур ферментов.

¶Строение и свойства

Молекула химотрипсина состоит из одной полипептидной цепи примерно из 240 аминокислотных остатков, уложенной в компактный глобулярный белок. В активном центре расположены три ключевых остатка — так называемая каталитическая триада: гистидин-57, аспартат-102 и серин-195 (нумерация для химотрипсина А). Серин выполняет роль нуклеофила, гистидин и аспартат обеспечивают перенос протона и стабилизацию переходного состояния.

Кроме того, в активном центре имеется гидрофобный «карман», который связывает боковую цепь субстрата. Именно форма этого кармана определяет специфичность: химотрипсин предпочитает объёмные ароматические остатки (фенилаланин, тирозин, триптофан), тогда как у трипсина карман содержит отрицательно заряженный остаток и узнаёт лизин и аргинин.

Основные характеристики:

• Класс — гидролазы; семейство — сериновые протеазы (S1).
• Оптимум pH — около 7,5–8,5.
• Молекулярная масса — около 25 кДа.
• Специфичность — гидролиз пептидных связей после ароматических и гидрофобных аминокислот.

¶Активация и регуляция

В ацинарных клетках поджелудочной железы химотрипсин синтезируется как химотрипсиноген — неактивный зимоген, лишённый ферментативной активности. Это защищает ткань железы от самопереваривания. Зимоген секретируется в просвет двенадцатиперстной кишки, где под действием трипсина отщепляется короткий активирующий пептид, и молекула приобретает активную конформацию.

Существует несколько изоформ — химотрипсин A, B и C, различающихся по заряду и некоторым каталитическим параметрам. Активация носит каскадный характер: трипсин, в свою очередь, образуется из трипсиногена под действием энтерокиназы (энтеропептидазы), вырабатываемой слизистой оболочкой кишечника. Такой каскад обеспечивает быстрое и регулируемое включение протеолиза только в нужном месте.

В поджелудочной железе присутствуют также ингибиторы сериновых протеаз (например, ингибитор Казаля), которые дополнительно ограничивают случайную активацию ферментов внутри железы.

¶Биологическая роль

Химотрипсин вместе с трипсином и карбоксипептидазами осуществляет расщепление белков пищи до коротких пептидов и свободных аминокислот, которые затем всасываются в тонкой кишке. Он гидролизует связи, которые трипсин не затрагивает, поэтому совместное действие ферментов обеспечивает более полное переваривание белков.

Помимо пищеварения, химотрипсин участвует в ряде физиологических процессов: активации некоторых зимогенов, процессинге пептидных гормонов, а также в защитных реакциях. У беспозвоночных и микроорганизмов обнаружены гомологичные сериновые протеазы, выполняющие сходные функции.

¶Применение

Благодаря высокой специфичности и способности расщеплять белки в мягких условиях химотрипсин широко применяется в лабораторной практике и биотехнологии:

• В протеомике — для ферментативного гидролиза белков перед масс-спектрометрическим анализом.
• В молекулярной биологии — для обработки клеточных культур, отделения клеток от подложки.
• В промышленности — при выделении и очистке биологически активных соединений.
• В медицине — в составе некоторых препаратов для обработки ран, разжижения вязких секретов и в офтальмологии при отдельных вмешательствах.

Фермент также служит модельным объектом в исследованиях механизмов ферментативного катализа: на его примере сформулированы представления о каталитической триаде и стабилизации переходного состояния.

¶Патологии, связанные с ферментом

Нарушения активации панкреатических ферментов лежат в основе острого панкреатита: преждевременная активация трипсиногена и химотрипсиногена внутри железы приводит к самоперевариванию ткани и воспалению. Врождённый дефицит панкреатических протеаз проявляется нарушением переваривания белков и белковой недостаточностью. Мутации в гене, кодирующем химотрипсиноген (CTRC), связывают с повышенным риском хронического панкреатита.

Определение активности химотрипсина в кале и дуоденальном содержимом используется в диагностике недостаточности поджелудочной железы.

¶Близкие ферменты

Химотрипсин входит в обширное семейство сериновых протеаз, куда относятся трипсин, эластаза, калликреины, факторы свёртывания крови и многие другие. Общность механизма катализа и структурного плана у этих ферментов — один из классических примеров конвергентной и дивергентной эволюции белков.