Пекарские дрожжи как система экспрессии¶

Пекарские дрожжи как система экспрессии — это применение одноклеточных грибов вида Saccharomyces cerevisiae (и близкородственных видов) в качестве организма-хозяина для гетерологичной экспрессии, то есть наработки чужеродных белков на основе введённых в клетку генетических конструкций. Данный подход относится к области генетической инженерии и биотехнологии и получил широкое распространение благодаря изученности физиологии дрожжей, скорости роста и способности выполнять посттрансляционные модификации, свойственные эукариотам.

¶Обоснование выбора

Дрожжи сочетают признаки, удобные для лабораторной и промышленной работы:

• быстрый рост на недорогих средах с удвоением популяции за 1,5–2 часа;
• отработанные методы трансформации и селекции;
• эукариотическая организация секреторного аппарата, позволяющая сворачивать и гликозилировать белки;
• отсутствие эндотоксинов, характерных для бактериальных систем.

По сравнению с бактерией Escherichia coli дрожжи обеспечивают корректный фолдинг многих эукариотических белков, а по сравнению с культурами клеток млекопитающих — существенно дешевле и технологичнее.

¶Основные штаммы и векторы

Исторически первым промышленным штаммом стал S. cerevisiae, использовавшийся в пивоварении и хлебопечении. Позднее распространились метилотрофные дрожжи Pichia pastoris (Komagataella phaffii), способные расти на метаноле и давать высокий выход белка под контролем промотора гена AOX1. Применяются также Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis и Schizosaccharomyces pombe.

Экспрессионные векторы обычно включают:

• селективный маркер (устойчивость к антибиотику или ауксотрофная комплементация);
• промотор (конститутивный, например GAP, или индуцибельный, например GAL1, AOX1);
• сигнальную последовательность для секреции;
• сайт интеграции в хромосому либо центромерную/эписомную последовательность.

¶Типы экспрессии

Различают внутриклеточную и секреторную экспрессию. В первом случае продукт накапливается в цитоплазме, что требует последующей дезинтеграции клеток. Во втором белок выводится в культуральную жидкость, что упрощает очистку. Секреция часто опосредуется сигнальным пептидом α-фактора S. cerevisiae.

Для повышения выхода применяют мультикопийные конструкции, оптимизацию кодонов, коэкспрессию шаперонов и подавление протеаз.

¶Применение

Дрожжевые системы экспрессии используются для получения:

Значительная часть рекомбинантного инсулина и вакцин против гепатита B производится именно в дрожжах.

¶Ограничения

Дрожжи не воспроизводят человеческий профиль гликозилирования: они добавляют высокоманнозные N-гликаны, что может вызывать иммунный ответ и сокращать время полужизни терапевтических белков в крови. Для устранения этого недостатка созданы штаммы с «гуманизированным» гликозилированием. Кроме того, выход сложных многодоменных белков часто ниже, чем в клетках млекопитающих, а сильная гиперэкспрессия может приводить к образованию телец включения и стрессу эндоплазматического ретикулума.

¶Значение

Пекарские дрожжи стали одной из базовых платформ промышленной биотехнологии: на них отработаны принципы масштабирования ферментёров, контроля метаболических потоков и синтетической биологии. Развитие методов CRISPR-редактирования и метаболического инжиниринга расширяет их применение, включая синтез биофармацевтических препаратов и продуктов тонкого химического синтеза.