Количественная ПЦР в реальном времени¶

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qPCR, quantitative real-time PCR) — молекулярно-биологический метод, позволяющий одновременно амплифицировать (размножать) определённый участок ДНК или РНК и измерять его исходное количество в образце по мере накопления продукта реакции. Относится к классу методов амплификации нуклеиновых кислот и сочетает классическую ПЦР с детекцией сигнала флуоресцентных красителей в каждой стадии цикла. Ключевое отличие от «конечной» ПЦР — измерение происходит не по завершении реакции, а непосредственно в её ходе, что даёт возможность количественной оценки и повышает точность.

¶Принцип метода

В основе лежит стандартная схема ПЦР: циклическое повторение стадий денатурации, отжига праймеров и элонгации, катализируемой термостабильной ДНК-полимеразой. В реакционную смесь дополнительно вводят флуоресцентные репортёры, интенсивность свечения которых пропорциональна количеству синтезированных копий целевой последовательности.

На ранних циклах флуоресценция остаётся на уровне фона. Когда число копий достигает порогового значения, сигнал начинает расти экспоненциально. Цикл, на котором кривая флуоресценции пересекает заданный порог (Ct, threshold cycle; иногда обозначается Cq), обратно пропорционален исходной концентрации матрицы: чем больше целевой ДНК в образце, тем раньше наступает пороговый цикл.

Зависимость Ct от логарифма начального количества копий линейна в широком диапазоне, что позволяет строить калибровочную кривую по стандартам с известной концентрацией и вычислять абсолютное число копий в неизвестных пробах.

¶Способы детекции

Выделяют два основных подхода к регистрации сигнала.

При использовании зондов применяют принцип FRET (фёрстеровского резонансного переноса энергии): флуорофор и гаситель разнесены на зонде, и свечение появляется лишь после отщепления гасителя полимеразой либо изменения конформации зонда.

¶Этапы анализа

Типичный эксперимент включает несколько стадий:

1. Пробоподготовка и выделение нуклеиновых кислот.
2. Обратная транскрипция (для анализа РНК) — синтез комплементарной ДНК.
3. Приготовление реакционной смеси с праймерами, зондами, нуклеотидами и полимеразой.
4. Амплификация с параллельной регистрацией флуоресценции в термоциклере с оптическим модулем.
5. Построение калибровочной кривой и расчёт концентрации.
6. Контроль качества: отрицательный контроль, внутренний контроль, анализ кривых плавления.

Для относительной количественной оценки применяют метод ΔΔCt, при котором уровень целевого гена нормируют на референсный (housekeeping) ген и сравнивают с контрольным образцом.

¶Применение

Метод широко используется в клинической диагностике и научных исследованиях:

• обнаружение и количественная оценка патогенов (вирусов, бактерий) — например, определение вирусной нагрузки;
• диагностика наследственных и онкологических заболеваний, анализ экспрессии генов;
• определение генотипов, выявление точечных мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов;
• контроль качества продуктов и ГМО-анализ в пищевой промышленности;
• судебная и экологическая экспертиза.

¶Преимущества и ограничения

К достоинствам относят высокую чувствительность (обнаружение единичных копий), широкий динамический диапазон (до 7–8 порядков), быстроту, возможность мультиплексирования и отсутствие необходимости в электрофорезе. К ограничениям — дорогостоящее оборудование и реагенты, чувствительность к ингибиторам в образце, риск контаминации и необходимость тщательного подбора праймеров и зондов.

¶Связь с другими методами

qPCR развился из классической ПЦР, предложенной Кэри Муллисом в 1983 году. Первые системы реального времени появились в 1990-х годах. Дальнейшим развитием стали цифровая ПЦР (dPCR), позволяющая абсолютное количественное определение без калибровки, и изотермальные методы амплификации. Для высокопроизводительного анализа экспрессии применяют микрочипы и секвенирование нового поколения, однако qPCR остаётся «золотым стандартом» количественной оценки нуклеиновых кислот благодаря точности и воспроизводимости.