Ионохромная хроматография и её применение¶

Ионохес (также распространено написание «Ионохром») — торговое наименование одного из первых промышленно выпускавшихся наборов ионообменных хроматографических сорбентов и связанной с ним методики ионообменной хроматографии, применявшейся для разделения смесей аминокислот, пептидов и других ионизируемых соединений. Термин закрепился в биохимической и аналитической литературе середины XX века как название технологии, объединявшей синтетические ионообменные смолы и стандартизированные буферные системы для градиентного элюирования.

¶История

Метод ионообменной хроматографии восходит к работам начала XX века: в 1935 году британские биохимики Арчер Мартин и Ричард Синг предложили теоретические основы распределительной и ионообменной хроматографии, за что в 1952 году получили Нобелевскую премию по химии. Практическое применение к разделению аминокислот развил в 1940-х годах Стэнфорд Мур и Уильям Стайн в Рокфеллеровском институте. Именно их работы по автоматизации анализа аминокислот на сульфированных полистирольных смолах легли в основу коммерческих наборов, получивших название «Ионохес».

Термин «Ионохес» (от англ. ion exchange — ионный обмен) использовался в русскоязычной научной литературе как транслитерация названия сорбентов и методик, поставлявшихся зарубежными производителями. В 1950–1970-х годах такие наборы широко применялись в СССР и странах Восточной Европы в биохимических лабораториях, поскольку собственные аналоги появились позже.

¶Принцип действия

В основе метода лежит обратимое взаимодействие ионизированных молекул анализируемой смеси с функциональными группами неподвижной фазы — ионообменной смолы.

¶Ионообменная смола

Носителем служит сшитый полимер (чаще всего сополимер стирола и дивинилбензола), на который привиты функциональные группы:

• Катионообменные — сульфогруппы (−SO₃H) или карбоксильные группы (−COOH), обменивающие катионы;
• Анионообменные — четвертичные аммониевые группы (−N⁺(CH₃)₃), обменивающие анионы.

Степень сшивки (процент дивинилбензола) определяет пористость и доступность функциональных групп для крупных молекул.

¶Процесс разделения

Разделение основано на различии в сродстве компонентов смеси к ионообменнику. Молекулы с большим числом заряженных групп или большей величиной заряда связываются прочнее и элюируются позже. Управление разделением достигается:

1. изменением pH элюента, что меняет степень ионизации разделяемых соединений;
2. изменением ионной силы (концентрации буфера) — градиентное элюирование;
3. подбором температуры, влияющей на кинетику обмена.

¶Детектирование

В классических установках элюат смешивался с нингидрином, дававшим цветную реакцию с аминокислотами, и регистрировался фотометрически. Современные варианты используют УФ-детекцию, флуоресценцию или масс-спектрометрию.

¶Состав набора

Типовой набор «Ионохес» включал:

¶Применение

Наибольшее распространение метод получил в следующих областях:

• Анализ аминокислот — количественное определение состава белковых гидролизатов, диагностика нарушений обмена аминокислот;
• Разделение нуклеотидов и нуклеозидов — изучение структуры нуклеиновых кислот;
• Очистка белков и пептидов — препаративное выделение;
• Водоподготовка — деминерализация воды, умягчение;
• Анализ органических кислот — в клинической биохимии и пищевой промышленности.

¶Развитие и место в аналитической химии

Ионообменная хроматография, к которой относится методика «Ионохес», стала предшественницей современных высокоэффективных методов: ионной хроматографии (разработана Хэмишем Смоллом в 1975 году) и ВЭЖХ с ионообменными сорбентами. Переход к мелкозернистым сорбентам (5–10 мкм) и высокому давлению позволил сократить время анализа с нескольких часов до десятков минут и повысить разрешение.

В современной практике классические наборы типа «Ионохес» вышли из массового употребления, уступив место автоматизированным аминокислотным анализаторам и хромато-масс-спектрометрическим системам. Тем не менее принципы, заложенные в этих наборах, сохраняются в основе работы современных ионообменных колонок.

¶Ограничения метода

• Чувствительность к составу буфера и температуре;
• Длительность анализа при классическом варианте;
• Ограниченная применимость для крупных белков из-за стерических затруднений в порах смолы;
• Необходимость калибровки по стандартным смесям.